miRNA-21在伊馬替尼敏感型胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及通過B淋巴細(xì)胞瘤-2基位點(diǎn)作用機(jī)制研究

背景胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是較常見的胃腸道間葉細(xì)胞瘤,其發(fā)病率占整個(gè)胃腸道腫瘤的2%,最初在上個(gè)世紀(jì)60年代,病理學(xué)層定義為平滑肌腫瘤或神經(jīng)源性腫瘤,直到1983年Mazur研究確定以胃腸道間質(zhì)瘤命名,其命名主要是依據(jù)腫瘤的分化特征而提出。胃腸道間質(zhì)瘤多見于中老年人,40歲以下病人極少見,發(fā)病中位年齡為50歲到60歲。一般60-70%多發(fā)于胃,20%到30%發(fā)生在小腸,只有10%以內(nèi)發(fā)生在食管、結(jié)腸和直腸。胃腸道間質(zhì)瘤在CT上主要表現(xiàn)為T1上腫塊實(shí)質(zhì)部分呈低信號,與肌肉信號相當(dāng),在T2上呈高信號,腫瘤中央可以發(fā)現(xiàn)含氣的壞死腔和腫瘤鈣化的無信號區(qū)域,如果腫瘤中央內(nèi)出現(xiàn)出血,會出現(xiàn)時(shí)間不同的混雜信號。胃部的胃腸道間質(zhì)瘤占胃部腫瘤的2%-3%,發(fā)病部位一般位于胃體,胃竇發(fā)病率較低,形態(tài)大小不一,大者還可以超過30cm,大多數(shù)病變腫瘤瘤體可以向胃外生長,或者向腹膜腔蔓延。生長在小腸的胃腸道間質(zhì)瘤占整個(gè)胃腸道間質(zhì)瘤的20%,全段小腸均可發(fā)生,其中30%的病變多發(fā)生于十二指腸,空腸病變多于回腸,通常發(fā)生在小腸的胃腸道間質(zhì)瘤,其腫瘤體積較大,惡性程度較高,其病變一般位于腸腔外,病變多為偏心性,有些小腸壁可見像動脈瘤樣擴(kuò)張,其主要機(jī)制是腫瘤引起腸管皺縮及神經(jīng)叢受損,影像學(xué)口服造影劑檢查多可以發(fā)現(xiàn)腸瘺管,向管腔內(nèi)生長者,表現(xiàn)為腸梗阻；發(fā)生于肛門和直腸的胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)病率不足十分之一,一旦發(fā)生絕大部分為惡性,其中2/3以上惡性程度高,具有侵襲的可能,腫瘤組織多為向腸腔內(nèi)生長,境界清晰,中心可見壞死病變和囊腔。結(jié)腸的胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)病率最低,通常是小腸或胃部的惡性間質(zhì)瘤瘤體轉(zhuǎn)移到結(jié)腸,一般結(jié)腸的間質(zhì)瘤同上,損傷結(jié)腸壁,向腹腔蔓延。食管的胃腸道間質(zhì)瘤占整個(gè)胃腸道間質(zhì)瘤的1/4,患病年齡中位數(shù)是63歲,通常惡性程度高,食管的胃腸道間質(zhì)瘤要與食管的其他病變鑒別,小型的食管腫物,多為食管平滑肌瘤,如果腫瘤體積較大,要與晚期食管癌和淋巴瘤或者縱膈腫瘤侵犯食管鑒別。胃腸道間質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移以肝臟轉(zhuǎn)移最常見,轉(zhuǎn)移灶CT掃描,可呈低密度,也可呈等密度,轉(zhuǎn)移灶的壞死病變較多,但是壞死后很少出血,如果胃腸道間質(zhì)瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,多表現(xiàn)為全腹部多發(fā)性腫塊,病變一般較小,境界清楚,一般不出現(xiàn)腸系膜的侵潤和牽拉。胃腸道間質(zhì)瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移很少見,因此如果在腫瘤組織周圍間淋巴結(jié)腫大,則胃腸道間質(zhì)瘤的可能性不大,胃腸道間質(zhì)瘤肺轉(zhuǎn)移很少見,因此,胃腸道間質(zhì)瘤一般是沿著靜脈轉(zhuǎn)移,這個(gè)特征也是胃腸道間質(zhì)瘤與平滑肌肉瘤的主要不同之處。從病理組織學(xué)上看,瘤細(xì)胞狹長,呈波浪狀,胞漿略嗜酸性,細(xì)胞界限不清,核梭形,兩端細(xì)。胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤最具特征的標(biāo)記物是CD117,主要應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法即可檢測,還有部分胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤還可以表達(dá)CD34,正常胃腸道肌層內(nèi)CAJAL細(xì)胞核肥大細(xì)胞CD117陽性,而平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞核神經(jīng)纖維不表達(dá)CD117。胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞起源于胃腸壁肌層的卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞,其主要作用是胃腸道神經(jīng)叢節(jié)律起搏細(xì)胞。電鏡下,瘤細(xì)胞表面有較多樹突狀突起,胞漿內(nèi)有少量細(xì)絲和神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒,與CAJAL細(xì)胞相似。通常胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤在胃部直徑大于5.5cm,在腸部大于4cm,核分裂現(xiàn)象在胃部大于5/50HPE,在腸道大于1/50 HPE,腫瘤表現(xiàn)為壞死樣外觀,核異型性明顯,腫瘤細(xì)胞豐富,生長活躍,上皮樣細(xì)胞呈細(xì)胞巢或腺泡樣排列一般惡性化程度高,但現(xiàn)今尚無有效的指標(biāo)能有預(yù)測胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移和惡化行為,有些專家推薦使用腫瘤的大小和核分裂作為轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性評估指標(biāo),但是方法尚不可靠。胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤長期以來一直被診斷為平滑肌肉瘤或惡性神經(jīng)鞘瘤,隨著免疫組織化學(xué)、電子顯微鏡和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)該腫瘤存在C-kit基因突變及蛋白表達(dá),才有突破新進(jìn)展,組織學(xué)上多有未分化或多功的梭形細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞組成。間質(zhì)瘤在性質(zhì)上與其他腫瘤不甚相同,從其生物學(xué)性質(zhì)上可分為良性、交界性和惡性腫瘤。胃腸道間質(zhì)瘤惡性的表現(xiàn)主要是腫瘤具有浸潤侵蝕性,常常在基層侵潤或粘膜層侵潤,或者發(fā)現(xiàn)腫瘤有遠(yuǎn)處臟器和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。潛在的惡性的指標(biāo)有腫瘤直徑大于5cm,核分裂相大于5/50hpf,腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)壞死,腫瘤細(xì)胞有明顯的核異型性。我們通常應(yīng)用以下依據(jù)來判定胃腸道間質(zhì)瘤的良惡性,具備惡性指標(biāo)1項(xiàng)或2項(xiàng)以上潛在惡性指標(biāo)診斷為惡性胃腸道間質(zhì)瘤,如果僅僅有一項(xiàng)潛在的惡性指標(biāo)為交界性胃腸道間質(zhì)瘤,如果沒有上述指標(biāo)即可診斷為良性。胃腸道平滑肌瘤與間質(zhì)瘤的區(qū)別主要有：胃腸道平滑肌瘤一般發(fā)病年齡較輕,瘤細(xì)胞較稀少,形態(tài)單一,A-Mat(+),CD 117(-),CD34(-),無C-KIT基因突變,而胃腸道間質(zhì)瘤一般發(fā)病年齡大,瘤細(xì)胞形態(tài)多變,排列結(jié)構(gòu)多樣,A-Mat(-),CD 117(+),CD34(+),有C-KIT基因突變。胃腸道間質(zhì)瘤目前主要臨床治療方法,以外科治療為主,由于微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展,內(nèi)鏡下ESD的剝離越來越讓到廣大患者接受。完整切除是手術(shù)療效提高的表現(xiàn),在手術(shù)中無瘤操作,并在術(shù)中要防止腫瘤破潰,術(shù)后復(fù)發(fā)或不能手術(shù)的病人一般可以選擇腫瘤分子靶向藥物的治療。胃腸道間質(zhì)瘤的大小其直徑可以從1-2cm大到20cm,一般呈局限性生長,多數(shù)腫瘤沒有完整的包膜,有時(shí)具有假包膜,惡性化程度高,有時(shí)伴有壞死局灶性出血和腫瘤組織破裂,有時(shí)可以穿破粘膜層導(dǎo)致消化道潰瘍。消化道間質(zhì)瘤一般見于粘膜下層,通常占整個(gè)間質(zhì)瘤的百分之六十,比例最少的是局限于肌層,僅僅占整個(gè)胃腸道間質(zhì)瘤的十分之一。一般胃腸道間質(zhì)瘤外形呈息肉狀,息肉常伴有潰瘍,多向胃腸道腔內(nèi)生長,向漿膜層生長一般形成漿膜下腫瘤。位于腹腔內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞瘤腫塊一般體積較大,粘膜面一般有潰瘍形成,可有出血、壞死粘液和囊性變等等,切開腫瘤呈結(jié)節(jié)狀或分葉狀,切面呈紅色或灰白色,內(nèi)部堅(jiān)硬。手術(shù)切除是唯一可以治愈早期胃腸道間質(zhì)瘤的方式,一般可以做局部切除和楔形切除,一般切除的范圍要大于腫瘤包膜外2厘米,胃腸道間質(zhì)瘤高?；颊呤中g(shù)后復(fù)發(fā)率較高,據(jù)相關(guān)報(bào)道,復(fù)發(fā)率可以到達(dá)80-91%,約85%的患者在手術(shù)后2-3年可以復(fù)發(fā),通常復(fù)發(fā)的過程還伴有肝臟的轉(zhuǎn)移,一旦復(fù)發(fā),其再治療的可能性就很低,據(jù)相關(guān)研究,即便再次手術(shù)切除,也很難提高患者的生存率,如果胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)較早,包膜完整沒有轉(zhuǎn)移,其手術(shù)切除后5年生存率達(dá)到一半,如果切除時(shí)包膜不完整,向粘膜層侵襲,或者切除不徹底,其手術(shù)切除后5年生存率小于35%,不能切除者總生存時(shí)間為一年。伊馬替尼為蛋白絡(luò)氨酸激酶小分子抑制劑,而絡(luò)氨酸激酶能催化底物磷酸化,在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號,激發(fā)細(xì)胞增殖,絡(luò)氨酸激酶的活性部位均有ATP結(jié)合口袋,絡(luò)氨酸激酶的活性即是通過催化ATP轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)到底物的絡(luò)氨酸殘基上,也就是通常所說的激酶的磷酸化。伊馬替尼第一個(gè)適應(yīng)癥是慢性粒細(xì)胞性白血病,而第二個(gè)適應(yīng)癥是胃腸道間質(zhì)瘤。伊馬替尼能夠選擇性的使PDGERA受體絡(luò)氨酸激酶抑制,對于胃腸道間質(zhì)瘤中晚期或者手術(shù)不能治療,或存在惡性轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)的患者的預(yù)防性治療,對于提高患者的預(yù)后和延長生存時(shí)間具有重要的意義。伊馬替尼耐藥主要是由于胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤表達(dá)野生型的KIT或者是外顯子9突變,其主要機(jī)制是突變導(dǎo)致KIT結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,阻止了其與伊馬替尼的結(jié)合。伊馬替尼作為選擇性KITPDGFRA受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑,主要應(yīng)用于不能手術(shù)切除,或者切除后轉(zhuǎn)移的病例,或者是切除后復(fù)發(fā)的病患,或者是完整切除后預(yù)防性的治療,以防止胃腸道間質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。通常,如果手術(shù)治療后發(fā)現(xiàn)以下現(xiàn)象則高度懷疑復(fù)發(fā),首先是在切除部位或者是原發(fā)灶又發(fā)現(xiàn)新的腫瘤組織,或者是原發(fā)灶的周圍出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,或者是患者正在實(shí)施伊馬替尼治療的過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤灶還在逐漸增大,影像學(xué)診斷發(fā)現(xiàn),原發(fā)灶密度增高。如果能夠直接進(jìn)行手術(shù)治療的,要盡早手術(shù)切除,如果不能進(jìn)行手術(shù)治療的,要先行伊馬替尼治療后如果可能再行手術(shù)治療。有研究表明,手術(shù)聯(lián)合伊馬替尼及化療藥物聯(lián)合治療可以顯著的提高胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的預(yù)后。但是在伊馬替尼治療過程中,胃腸道間質(zhì)瘤的耐藥率較高,甚至高到70%,有些患者表現(xiàn)為治療之初就耐藥,一般發(fā)生率為20%,通常伊馬替尼在連續(xù)性用藥治療胃腸道間質(zhì)瘤半年后發(fā)現(xiàn)腫瘤繼續(xù)生長,而且呈多病灶生長,一般患者耐藥其基因型多表現(xiàn)為GIST野生型KIT的外顯子9突變；繼發(fā)性耐藥現(xiàn)在學(xué)術(shù)界主要的觀點(diǎn)是突變導(dǎo)致KIT的穩(wěn)定,KIT的穩(wěn)定阻滯了KIT結(jié)構(gòu)域與伊馬替尼的結(jié)合,還有其他突變的部位是外顯子12、14和17。miRNA最早是在1993年由LEE在線蟲中發(fā)現(xiàn)了長約22nt的非編碼單鏈小RNA-lin-4,該實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)由不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA能夠調(diào)控生物體發(fā)育的過程,后來將該小分子RNA命名為miRNA,2000年有學(xué)者又在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)miRNA基因稱異時(shí)開關(guān)基因let-7,發(fā)現(xiàn)其主要功能是控制線蟲向成蟲生長,2002年,CALIN在臨床慢性淋巴細(xì)胞白血病患者血液中發(fā)現(xiàn)miRNA部分缺失或者表達(dá)下降,2005年,有研究發(fā)現(xiàn)miRNA與某些腫瘤的發(fā)生相關(guān),也有發(fā)現(xiàn)miRNA與特定的靶基因例如MiR15/16h和let-7作用對于癌癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的作用,研制新的癌癥藥物基因靶點(diǎn)具有重要的意義和價(jià)值。miRNA分子鏈較小,一般為19-25個(gè)核苷酸分子的單鏈小RNA分子,成熟的miRNA的5’端有磷酸基團(tuán),3’端為羥基,miRNA主要在DNA的修復(fù)過程中抑制或組織正常細(xì)胞DNA修復(fù)產(chǎn)生致癌作用,同時(shí)抑制或阻止癌細(xì)胞DNA修復(fù)達(dá)到治療的效果。miRNA基因序列和位置高度保守,表達(dá)和結(jié)構(gòu)多樣性,可以作為mRNA的調(diào)節(jié)因子,主要對細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖起到調(diào)節(jié)作用,同時(shí)與應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染、脂肪代謝及癌癥和心血管疾病均有相關(guān)性,人類基因組中有一半以上的已知miRNA成簇表達(dá),其表達(dá)彼此相關(guān)。miRNA分子序列短小,其基因組中存在較多的互補(bǔ)序列,在不同的生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不一樣,一般與多種蛋白結(jié)合,至今,miRBase公布miRNA的總數(shù)大約為3200余種,一般現(xiàn)階段miRNA的檢測主要通過基因克隆或者生物學(xué)篩選所得。miRNA對于癌癥相關(guān)的作用主要表現(xiàn)在,影響癌基因的表達(dá),主要是通過let-7miRNA調(diào)節(jié)RAS蛋白的表達(dá)水平,其次,通過研究慢性淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)現(xiàn),miR-15/16靶向調(diào)節(jié)BCL2而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,再次,通過C-myc在激活E2F1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄同時(shí),通過miR-17/20也減少E2F1的表達(dá),最后,有研究報(bào)道可以通過miRNA表達(dá)譜用于人類腫瘤的分類,miRNA作為腫瘤的分類依據(jù),不但能夠顯示區(qū)分正常和腫瘤,還可以進(jìn)一步區(qū)分不同的腫瘤組織類型和正常組織類型。miRNA的檢測方法是對miRNA在生物細(xì)胞調(diào)控作用研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ),如何快速、準(zhǔn)確的定量檢測miRNA是揭示細(xì)胞生長、凋亡、死亡或者異常生長的關(guān)鍵。通常的方法是Northern blotting法,全部的生物信息學(xué)分析都是需要Northern blotting法來驗(yàn)證和確認(rèn)。但該方法靈敏度低,檢測效率低。RT-PCR或者稱為反轉(zhuǎn)錄PCR法也可以檢測miRNA前體的表達(dá)含量,但前體的表達(dá)與成熟miRNA的表達(dá)往往水平不等,實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠較為精確的定量分析miRNA的表達(dá),通?？梢酝ㄟ^延生引物的方法,在5’端進(jìn)行標(biāo)記,可以定量的測量豐度較低的RNA的含量。原位雜交技術(shù)可以確定miRNA的空間結(jié)構(gòu)及表達(dá)的差異。但近期的研究我們也發(fā)現(xiàn),新的miRNA發(fā)現(xiàn)頻率越來越高,但是miRNA的功能研究相對緩慢,主要是由于miRNA作用靶點(diǎn)難以確認(rèn)。大量的研究發(fā)現(xiàn)癌癥組織存在異常的miRNA, miRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起到特定的調(diào)節(jié)作用,尤其是在抑制某類蛋白質(zhì)表達(dá)方面起到重要的作用。研究miRNA對于癌癥的治療具有重大意義。尤其是近年來發(fā)現(xiàn),癌癥的發(fā)生與某些蛋白關(guān)系密切,這類蛋白能激活癌基因,因此miRNA與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域相關(guān),目前RNAi技術(shù)可以在體外培養(yǎng)細(xì)胞中沉默內(nèi)源性基因,利用RNAi技術(shù)降低惡性癌癥細(xì)胞中癌基因成為腫瘤藥物治療的新的思路。因此,未來如果能夠進(jìn)一步深入的研究miRNA在生物發(fā)育中的作用,揭示其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生命發(fā)展過程,并通過對腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究,為進(jìn)一步認(rèn)識腫瘤的起因,為腫瘤的診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)。近年來對于miRNA-21與癌癥的研究較多,大量的實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)或者免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miRNA-21在多種癌癥組織或細(xì)胞中陽性表達(dá),主要包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤,消化系統(tǒng)腫瘤(胃癌,食管癌,膽管癌,肝癌、口腔癌)生殖系統(tǒng)癌癥(卵巢癌、宮頸癌)等等。如上所說miRNA-21的致癌機(jī)制尚不清楚,主要是由于其作用靶點(diǎn)難以確認(rèn),但近年來隨著利用Northern blotting法,全部的生物信息學(xué)分析技術(shù)的深入研究,現(xiàn)主要發(fā)現(xiàn)miRNA-21靶基因主要有33個(gè)的位點(diǎn),其主要的位點(diǎn)有PTEN,主要的作用是抑制細(xì)胞遷移。增殖等,NFTB,主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子作用,STAT3,調(diào)控轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞運(yùn)動等。APAF-1,調(diào)控細(xì)胞凋亡等。以上因子都是確認(rèn)由miRNA-21直接的靶基因,以上因子的動態(tài)變化都受miRNA-21的直接調(diào)控。但是也有一些不是miRNA-21的直接靶基因,但也受miRNA-21的調(diào)控,例如,BCL-2和TIMP3等,他們往往通過別的介導(dǎo)因子從而受miRNA-21的調(diào)控。以上因子的調(diào)控雖然都與miRNA-21相關(guān),但是許多過程也不僅僅和miRNA-21相關(guān),是1miRNA-21協(xié)同其他miRNA共同作用調(diào)控,因此,miRNA-21的調(diào)控過程是較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有學(xué)者研究對酒精敏感的靶基因,發(fā)現(xiàn)JAG-1是miRNA-153, miRNA-335和miRNA-21共同的基因靶點(diǎn),單獨(dú)敲除其中的一項(xiàng),都不會影響神經(jīng)細(xì)胞對酒精的敏感性。miRNA-21的表達(dá)過程通常是在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶生成轉(zhuǎn)錄前體,通過加工成發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì),最后剪切成熟。上個(gè)世紀(jì)八十年代末,由日本人十本等首先從非霍其金淋巴瘤細(xì)胞染色體中分離出Bcl-2基因,而該基因的存在與Bcl-2蛋白的表達(dá)相關(guān)。Bcl-2蛋白大小為26KD,其中含有BH4同源結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)與抗凋亡蛋白的結(jié)構(gòu)類似,BH3結(jié)構(gòu)與其他促凋亡的蛋白結(jié)構(gòu)類似,因此Bcl-2蛋白的作用與其兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)的比例相關(guān),抗凋亡結(jié)構(gòu)的比例高,Bcl-2蛋白就呈現(xiàn)抗凋亡的作用,反之亦然。Bcl-2主要存在于線粒體外膜,核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Bcl-2蛋白家族分為兩類,一類是抗凋亡蛋白,例如Bcl-XL, Bcl-W,A1等,另一類促凋亡的蛋白有BAX,BAK等。通常Bcl-2家族分為三大類,抗凋亡的Bcl-2蛋白主要結(jié)構(gòu)中包含BH1/BH2/BH3/BH4等,直接或間接抑制細(xì)胞死亡,促凋亡蛋白BAX,BAK,其結(jié)構(gòu)中主要含有BH1/BH2/BH3,具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞生成的作用。BH3-only,其主要的功能為增敏劑和誘導(dǎo)劑的作用,既可以促進(jìn)凋亡作用,又可以促進(jìn)抑制凋亡的作用。Bcl-2的抑制凋亡作用主要有五個(gè)通路,分別為維持細(xì)胞鈣的穩(wěn)定狀態(tài),阻止線粒體膜電位下降；抑制促凋亡BAX/BAK的細(xì)胞毒性作用,維持二者的穩(wěn)定性,阻止其二聚體的形成。保護(hù)線粒體膜的功能抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C、AIF等促凋亡蛋白的釋放,同時(shí)可以減少細(xì)胞氧化和氧化物的形成。而以上的分析說明,對于miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的表達(dá)情況尚未有相關(guān)報(bào)道,探索miRNA-21的表達(dá)與伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性尚未有相關(guān)研究,探索研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的相互關(guān)系及作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用基因靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),而胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展均較為隱匿,藥物治療效果不很理想,因此,臨床急需對于胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入研究,為開發(fā)靶向治療藥物,提高其治療效果,減少病患痛苦提供新的思路和方法。目的本文預(yù)通過研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的表達(dá)情況,探索miRNA-21的表達(dá)與伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性,為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤治療新的藥物靶點(diǎn)提供有效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,我們又進(jìn)一步研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的相互關(guān)系及作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用基因靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),其研究成果可以直接應(yīng)用到胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤藥物開發(fā)和臨床治療,無論是對于提高胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效果,降低其患者醫(yī)療花費(fèi)和社會家庭的負(fù)擔(dān)均具有重大意義。為其相關(guān)miRNA-21與Bcl-2靶點(diǎn)的抗癌藥物的開發(fā)在臨床應(yīng)用的進(jìn)一步推廣提供科學(xué)依據(jù)。方法1.胃腸道間質(zhì)瘤組織樣本獲取,胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞培養(yǎng)我們收集了2013年10月至2015年10月期間,在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及廣州南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院就診并診斷為胃腸道間質(zhì)瘤的患者31例,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及廣州南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會審核通過,全部患者在進(jìn)行標(biāo)本獲取前均簽署知情同意書,收集的病例標(biāo)本我們統(tǒng)計(jì)了病患的性別、年齡、臨床表現(xiàn)、腫瘤位置,大小及其病理分型。于Cosmo Bio Co. Ltd (Tokyo, Japan)公司購買胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞,細(xì)胞用DMEM配方其主要組成為細(xì)胞溶液中添加10%的胎牛血清,1% v/v的青霉素和1%v/v的鏈霉素(Ameresco, Framingham, MA, USA).將細(xì)胞種植在培養(yǎng)瓶中,在5% CO2、370C的加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將濃度為85%的胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞在加有2%小牛血清和5uM的伊馬替尼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng),培養(yǎng)的細(xì)胞作為伊馬替尼藥物干擾細(xì)胞組。我們利用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)試劑盒轉(zhuǎn)染生成含有非特異靶標(biāo)miRNA和含有miRNA-21的85%胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞,并在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)。2.RNA的提取與定量測量利用TRIzol試劑盒(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)從胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞,正常胃組織作為照組組標(biāo)本中提取總mRNA,并滴加核糖核酸酶抑制劑SUPERase·InTM(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)lul,通過RT-qPCR對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增,42℃C,5 min,接著95℃,10秒鐘逆轉(zhuǎn)錄,95℃,5秒,60 ℃,20秒,共40個(gè)循環(huán)。用Takara One Step RT-PCT kit (Takara, Tokyo, Japan)試劑盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的miRNA用miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX,USA)試劑盒進(jìn)行提取,利用1nirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)試劑盒和Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR儀對miRNA-21的表達(dá)進(jìn)行定量測量,Bcl-2 or miRNA-21倍數(shù)變化以β-actin orU6為內(nèi)參采用△△Ct= ACt(stimulus)-ACt(solvent), ACt= Ct (target gene)-Ct(contol gene)公式進(jìn)行計(jì)算,基礎(chǔ)表達(dá)水平利用2-(△Ct)公式進(jìn)行計(jì)算3.熒光素酶印跡實(shí)驗(yàn)我們用熒光素酶把載體插入三個(gè)相同的miRNA-21的靶位點(diǎn)Bcl-2基因3’UTR位點(diǎn),利用脂質(zhì)體2000將Bcl-2位點(diǎn)和Bcl-2mut位點(diǎn)轉(zhuǎn)染到濃度為85%胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞,同時(shí)將30和60 nM miRNA-21和對照小RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)24小時(shí)后利用雙熒光素試劑盒(Promega, Madison, WI, USA)進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、MTT比色法和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞種植在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個(gè)孔有300個(gè)細(xì)胞,12小時(shí)后培養(yǎng)板分為兩組,第一組加入0 μM伊馬替尼,第二組加入5μM伊馬替尼,并且將60 nM非特異靶標(biāo)miRNA和miRNA-21對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)于37攝氏度5%C02箱中96個(gè)小時(shí),(0.005%)結(jié)晶紫染色胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞30分鐘,記錄克隆數(shù)量。用MTT比色法主要檢測處理后的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞活力,其過程簡單描述如下,將胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板上,12小時(shí)后培養(yǎng)板分為兩組,第一組加入0μM伊馬替尼,第二組加入5 μM伊馬替尼,并且將60 nM非特異靶標(biāo)miRNA和miRNA-21對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)于37攝氏度5%C02箱中48個(gè)小時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)液換成MTT溶液在37攝氏度培養(yǎng)2小時(shí),在分光光度計(jì)上在450nm的光波下測量其光密度。細(xì)胞活性主要測量胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞和對照組細(xì)胞活性相對比值,用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abeam, Cambridge, UK)試劑盒對胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行染色,通過流式細(xì)胞儀檢測胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞在伊馬替尼處理miRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡水平結(jié)果1.胃腸道間質(zhì)瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及兩者的相關(guān)性分析我們分析比較了全部31例胃腸道間質(zhì)瘤病例特征(表1示),在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi),定量測量了miRNA-21和Bcl-2表達(dá),其中miRNA-21/U6相對量為0.6729±0.07632,其含量顯著低于正常胃組織細(xì)胞的含量(1.0000±0.1085)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0129),而Bcl-2 mRNA水平在胃腸道間質(zhì)瘤組中(1.500±0.1484)顯著性高于正常胃組織細(xì)胞的含量(1.0000±0.1085)(p=0.0103),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著比較了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之間的相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系,(R2=0.2450,p=0.0046),總之,在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中,miRNA-21水平下調(diào),Bcl-2上調(diào),兩者呈顯著性負(fù)相關(guān)。2.在胃腸道間質(zhì)瘤中iRNA-21的作用位點(diǎn)Bcl-2的3’端非編碼區(qū)與Bcl-2上調(diào)的機(jī)制的關(guān)系為了進(jìn)一步研究在胃腸道間質(zhì)瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的相關(guān)性及Bcl-2上調(diào)的機(jī)制,我們通過對胃腸道間質(zhì)瘤-TI細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics,然后測量Bcl-2的表達(dá)。表2顯示,與轉(zhuǎn)染miRNA相比,轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞miRNA-21水平顯著上調(diào)(p<0.001 or p<0.0001 for 30or 60 nM),而與miRNA-21相反,Bcl-2 mRNA的水平在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào),(p<0.05 or p<0.01 for the 30 or 60 nM,).同樣,我們在蛋白水平也證實(shí)了Bcl-2蛋白在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào)(p<0.05 or p<0.01).為了證實(shí)否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區(qū),而使Bcl-2的下調(diào),我們在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics和轉(zhuǎn)染對照miRNA的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行比較,采用了熒光素酶活性檢測來研究Bcl-2的3’非編碼區(qū)質(zhì)粒報(bào)告和單純Bcl-2的3’非編碼區(qū)報(bào)告,圖3為質(zhì)粒報(bào)告和Bcl-2mut報(bào)告結(jié)構(gòu)流程圖,熒光素酶報(bào)告顯示,與對照組轉(zhuǎn)染RNA的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(p<0.001 for 30 or 60nM),而Bcl-2mut報(bào)告miRNA-21 mimics并無降低熒光素酶,以上研究證實(shí)了在胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區(qū),而使Bcl-2的下調(diào)。3.miRNA-21可以使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對伊馬替尼敏感我們采用克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA-21是否能使細(xì)胞對伊馬替尼治療敏感,5 μM伊馬替尼顯著降低胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆(p<0.01),同樣,與對照組轉(zhuǎn)染miR的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞比較,5μM伊馬替尼顯著降低轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆(p<0.001,p<0.05).,同時(shí),我們檢測了轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用伊馬替尼處理的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的活性和細(xì)胞凋亡率,轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性無差異,而轉(zhuǎn)染60nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用5μM伊馬替尼處理24或48小時(shí)候,胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性顯著性降低。(p<0.05 or p<0.01),轉(zhuǎn)染60 nMmiR-21 mimics并用伊馬替尼處理的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞下降的幅度比miR對照更大(p<0.05伊馬替尼處理24小時(shí)或48小時(shí)),同時(shí)我們檢測到伊馬替尼誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,(p<0.05伊馬替尼處理24小時(shí)或48小時(shí)),因此,miRNA-21可使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對伊馬替尼藥物的敏感性增強(qiáng)。結(jié)論1、我們成功的培養(yǎng)了胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞T1的模型,為進(jìn)一步研究胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的特性奠定了基礎(chǔ)。2、miRNA-21在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較正常胃粘膜細(xì)胞降低,而Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)比正常胃粘膜細(xì)胞增高,miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系。3、轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞miRNA-21水平顯著上調(diào),而Bcl-2 mRNA的水平在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào),在蛋白水平也證實(shí)了Bcl-2蛋白在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào)。4、在胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區(qū),而使Bcl-2的下調(diào)。5、伊馬替尼顯著降低胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆。6、伊馬替尼顯著降低轉(zhuǎn)染miR-21 mimics胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆。7、轉(zhuǎn)染miR-21 mimics和miR Control對照的并用胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性無差異,而轉(zhuǎn)染miR-21 mimics和niR Control對照的并用伊馬替尼處理可以使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性顯著性降低。因此本文通過研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的表達(dá)情況,探索miRNA-21的表達(dá)與伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性,為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤治療新的藥物靶點(diǎn)提供有效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質(zhì)瘤中的表現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān),miRNA-21通過作用于Bcl-2的3’非編碼區(qū)使其下調(diào),并且miRNA-21可提高胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接應(yīng)用到胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤藥物開發(fā)和臨床治療,無論是對于提高胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效果,降低其患者醫(yī)療花費(fèi)和社會家庭的負(fù)擔(dān)均具有重大意義。