FOXO1通過誘導(dǎo)心肌細胞自噬降低氧化自由基對其細胞損傷的分子生物學(xué)機制研究

研究背景：冠狀動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心肌梗死的主要病因,心肌梗死后的靜脈溶栓和冠脈內(nèi)支架植入,可以恢復(fù)梗死區(qū)域的血液供應(yīng),但是同時又會導(dǎo)致心肌細胞的缺血再灌注損傷。缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞損傷主要是由于氧化自由基對其細胞代謝的影響,使心肌纖維化、心臟肥大,最終導(dǎo)致心肌細胞死亡,而以上病理過程最終結(jié)局為導(dǎo)致患者心力衰竭和患者死亡。活性氧簇(Overloaded reactive oxygen species,ROS),例如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷細胞DNA、蛋白和脂肪,從而導(dǎo)致細胞活力降低甚至凋亡,而另一方面,包括AMP活性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK), Sirts和活性磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶在內(nèi)的機制可以對抗活性氧簇對心肌細胞的損傷,起到保護細胞功能的作用。長期一定量的Sirts表達誘導(dǎo)心肌細胞抗氧化和凋亡,因此人們認為對于AMP活性蛋白激酶基因敲除的小鼠,AMP活性蛋白激酶缺陷可以促進活性氧簇對于心肌細胞的損傷,綜上所述,研究抗氧化應(yīng)激損傷心肌細胞的通路,對于冠心病缺血再灌注損傷治療意義重大。F0X01是轉(zhuǎn)錄因子FOX0亞家族中的主要成員之一,稱為叉頭框轉(zhuǎn)錄因子。人FOX01基因定位于13號染色體,編碼655個氨基酸。FOXO1蛋白包含4個結(jié)構(gòu)域：依次為N端的forkhead區(qū)域(此區(qū)域同時也是DNA結(jié)合域)、核定位信號肽、核輸出序列和C端富含脯氨酸和絲/蘇氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域。F0X01基因廣泛分布于成人的各組織器官中,如心臟、腦、胎盤、肺臟、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血白細胞中。FOXO1和FOXO3等Forkhead box O轉(zhuǎn)錄因子對于處于心肌細胞之外其他的各類細胞分化、代謝和衰老均具有一定的作用。有研究表明,先天性FOXO1或FOXO3缺陷的小鼠通常會發(fā)生胚胎血管異?；蛘呃^而發(fā)生心肌肥厚,特別是近年來發(fā)現(xiàn),FOXO1是維持心肌細胞正常代謝和存活的關(guān)鍵,其主要機制是FOXO1通過Hippo-YAP信號通路降低心肌細胞對抗氧化應(yīng)激。除了以上外,機體還有其他多種信號通路對抗氧化應(yīng)激對機體組織細胞的損傷。SIN等研究報道,SIRT1主要通過白藜蘆醇作用到FOXO1-相關(guān)心肌細胞凋亡信號通路而發(fā)揮抵抗細胞氧化自由基的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)過氧化自由基會損傷細胞導(dǎo)致凋亡和活力下降,FOXOs是誘導(dǎo)細胞功能變化重要的調(diào)控因素,例如細胞分化和DNA修復(fù),大量的研究發(fā)現(xiàn),FOXOs家族對于細胞氧化自由基損傷具有重要的調(diào)控作用,FOXO1缺乏的造血干細胞對于氧化自由基損傷作用的耐受能力下降,其主要機制可能與FOXO1能活化轉(zhuǎn)錄SODs、過氧化氫酶,抗氧化酶和Prx3等抗氧化作用的酶類生成增多,同時,FoxOs會被氧化自由基、過氧化氫催化生成乙酰化或脫乙?；疐OXO蛋白而失去修復(fù)作用。磷酸化或乙?；疐OXOs是基因表達修飾的重要的方式,FOXO1活力主要是通過將FOXO1磷酸化后將其轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)被抑制,而FOXO1的乙?；軌蛟鰪奆OXO1的穩(wěn)定性,具有保護胰腺β細胞損傷的作用或者是通過轉(zhuǎn)錄激活Bim來促凋亡。有研究發(fā)現(xiàn),FOXO1磷酸化通過調(diào)節(jié)FOXO1的活性從而調(diào)節(jié)細胞生存和凋亡,然而對于心肌細胞如何通過FOXO1磷酸化調(diào)節(jié)FOXO1的活性尚不清楚。近年來有研究發(fā)現(xiàn),FOXO1具有促進細胞自噬的作用,FOXO1可以通過誘導(dǎo)RAS-相關(guān)GTP-binding蛋白RAB7A的表達從而促進細胞自噬,因此,FOXO1是否參與到氧化自由基對心肌細胞損傷的修復(fù)中,FOXO1與氧化自由基損傷的心肌細胞的凋亡和自噬的關(guān)系如何,有待于進一步的進行研究。因此,本文通過研究FOXO1對于心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的作用,從而揭示FOXO1的功能是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷還是保護損傷的心肌細胞,還是兩個兼有。同時進一步研究心肌細胞特異性缺失FOXO1促進氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細胞凋亡的機制和FOXO1過表達通過促進細胞自噬降低細胞凋亡的機制,本研究對于尋找抗心肌缺血再灌注損傷的藥物治療靶點,提高心肌梗死治療療效意義重大目的：1.通過過氧化氫培養(yǎng)心肌細胞模擬過氧化自由基對心肌細胞損傷,檢測過氧化氫對心肌細胞凋亡的影響,檢測FOXO1在蛋白、mRNA以及磷酸化水平的變化。以探討FOXO1對于心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的作用。2.利用轉(zhuǎn)染技術(shù)使FOXO1沉默,用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,檢測FOXO1 mRNA的含量、細胞凋亡比例。在200uM過氧化氫培養(yǎng)后,用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,檢測caspase 3含量、PARP含量、caspase 3活性、自噬囊泡的形成以及及LC3II與LC3I的比值,以探討FOXO1與過氧化氫培養(yǎng)下心肌細胞凋亡和自噬的相關(guān)機制。方法：1細胞系處理方法：培養(yǎng)人類心肌細胞系H9c2,不同濃度過氧化氫培養(yǎng)細胞來模擬細胞受到氧化自由基損傷的模型,將培養(yǎng)好的H9c2細胞放置于0uM、50uM、 100uM、200uM H2O2混合氣體中培養(yǎng)24到48小時。2過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測細胞凋亡H9c2心肌細胞用0uM和200uM過氧化氫分別培養(yǎng)24小時和48小時后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶對H9c2心肌細胞進行染色,然后用流式細胞分析儀進行細胞凋亡檢測,細胞凋亡的結(jié)果用凋亡細胞比全部細胞進行表示。3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達。0uM和200uM過氧化氫分別培養(yǎng)H9c2心肌細胞24小時和48小時,通過蛋白免疫印跡電泳法檢測caspase 3和PARP蛋白表達,通過熒光電泳法檢測H9c2心肌細胞的caspase 3活性的表達,4.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表達OuM、50uM、100uM、200uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后,用蛋白免疫印跡試驗檢測FOXOI蛋白水平和FOXO1磷酸化表達。5.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測FOXO1mRNA水平表達OuM、50uM、100uM、200uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后,用實時反轉(zhuǎn)錄PCR檢測FOXO1mRNA水平表達。6.用FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞,使FOXO1沉默通過轉(zhuǎn)染方法沉默F(xiàn)OXOI,用濃度為25nM、50nM的FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞,未用FOXO1-specific siRNA只有脂質(zhì)體處理的作為對照組。7.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,檢測FOXO1mRNA水平表達用25nM、50nM FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,用實時反轉(zhuǎn)錄PCR檢測FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照組FOXO1mRNA水平。8.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,檢測細胞凋亡用25nM、50nMm FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶對H9c2心肌細胞進行染色,然后用流式細胞分析儀檢測FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞組和空白對照組的細胞凋亡。9.200uM過氧化氫培養(yǎng)FOXOl-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達。200uM過氧化氫分別培養(yǎng)25nM、50nM FOXO1-specific siRNA心肌細胞和空白對照細胞后,通過熒光電泳法檢測caspase 3活性的表達,通過蛋白免疫印跡電泳法檢測caspase 3和PARP蛋白表達。10.過氧化氫培養(yǎng)FOXOl-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測細胞自噬0uM和200uM過氧化氫分別培養(yǎng)50nM轉(zhuǎn)染FOX01-specific siRNA心肌細胞和空白對照細胞后,利用綠色熒光蛋白染色觀察自噬囊泡,利用綠色熒光蛋白檢測儀定量檢測GFP-LC3、LC3Ⅱ/LC3I。統(tǒng)計學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,多組間不同組別間差異比較采用方差分析,有統(tǒng)計學(xué)意義后進行兩兩比較,采用LSD進行多重兩兩比較,兩組間比較采用雙尾t檢驗,顯著性水平設(shè)定為0.05,當P值小于0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測細胞凋亡：隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長,細胞凋亡增加。2.3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達。隨著過氧化氫培養(yǎng)濃度的增加、培養(yǎng)時間的延長,caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達增加。3.過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平和FOXO1磷酸化表達用OuM、50uM、100uM、200 uM過氧化氫培養(yǎng)H9c2心肌細胞,FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與以上規(guī)律相反,H9c2心肌細胞在用0uM、50uM、100uM、200uM濃度的過氧化氫培養(yǎng)下,隨著過氧化氫濃度的增高,FOXO1的磷酸化水平逐步升高,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,磷酸化程度與過氧化氫濃度呈計量依賴性。4.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞組和空白對照細胞組FOXO1mRNA的表達FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染細胞組FOXO1mRNA的表達低于空白對照細胞組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增大,FOXO1mRNA的含量逐漸減小,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5.FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照細胞凋亡檢測FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染細胞組細胞凋亡高于空白對照組間,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增大,細胞凋亡升高,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6.200uM過氧化氫培養(yǎng)FOXOl-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達。200uM的過氧化氫培養(yǎng)下的FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞的caspase3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達均高于空白對照組(P<0.05)。隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度增高而增高,caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達增高,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。7.過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測細胞自噬200 uM過氧化氫可以明顯誘導(dǎo)對照組細胞自噬囊泡的形成(綠色熒光蛋白陰性點),200 uM過氧化氫培養(yǎng)下,50nM FOXO1-specific siRNA細胞組自噬囊泡低于對照組(綠色熒光蛋白陰性點),200 uM過氧化氫培養(yǎng)下,50nMFOXO1-specific siRNA細胞組的GFP-LC3、LC3II/LC31低于對照組(P<0.05)。即FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞組降低過氧化氫誘導(dǎo)自噬(p<0.01).結(jié)論1.過氧化氫損傷心肌細胞造模成功,并將心肌細胞FOXO1沉默(用FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染H9c2細胞)。2.隨著過氧化氫濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長,心肌細胞凋亡、caspase 3、PARP蛋白水平及caspase 3活性升高,呈劑量依賴性。提示過氧化氫誘導(dǎo)凋亡。3.過氧化氫培養(yǎng)心肌細胞,FOXO1在蛋白和mRNA的水平未發(fā)生變化,隨著過氧化氫的濃度增高,FOXO1磷酸化水平升高,提示過氧化氫誘導(dǎo)心肌細胞凋亡可能是通過促FOXO1磷酸化,進而抑制FOXO1對心肌細胞的修復(fù)作用。4.在200uM過氧化氫培養(yǎng)后,隨著FOXO1-specific siRNA轉(zhuǎn)染濃度增高,細胞凋亡比例、caspase 3含量、PARP含量以及caspase 3活性增高。提示FOXO1沉默促進過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡,進而說明FOXO1抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。5.200uM過氧化氫誘導(dǎo)對照組細胞自噬囊泡的形成,過氧化氫培養(yǎng)FOXO1-specific siRNAH9c2轉(zhuǎn)染心肌細胞,自噬囊泡減少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低。提示過氧化氫誘導(dǎo)心肌細胞自噬,FOXO1沉默降低過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞自噬,進而說明FOXO1增強過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞自噬。