細菌脂多糖通過TLR-4通路抑制小鼠成骨細胞分化及基質(zhì)礦化的分子機制研究

骨折為臨床骨科最常見的疾病,骨折愈合主要分為誘導期、炎癥期、軟骨痂期、硬骨痂期和重建期,骨折愈合中阻礙任何一個環(huán)節(jié)均會影響骨折的愈合。骨折愈合參與的細胞較多,不同階段均有不同細胞參與,骨折血腫和炎癥期,局部組織在各種趨化因子的作用下,骨折斷端出現(xiàn)未分化的間充質(zhì)干細胞,淋巴細胞和巨噬細胞,肉芽組織降解激活骨折斷端成骨細胞,和骨生成前體細胞,成骨細胞和前體細胞增殖分化,生成細胞外基質(zhì),參與骨折愈合；在骨痂反應(yīng)期,由骨膜內(nèi)生發(fā)層和骨髓基質(zhì)內(nèi)生成的骨原細胞和誘導骨原細胞發(fā)生軟骨內(nèi)化骨,并向骨系細胞分化。在軟骨形成期,成纖維細胞參與合成和分泌膠原分泌鈣鹽等,同時軟骨細胞增殖分化和軟骨化骨逐漸成熟。在骨痂形成期,成骨細胞產(chǎn)生新骨基質(zhì),破骨細胞參與骨的改建。骨折愈合除了細胞參與外,還有各類膠原和細胞外基質(zhì)蛋白參與,任何細胞和蛋白功能受阻,都可能影響骨折愈合。開放性骨折常伴有細菌感染,而細菌感染釋放的毒素,會干擾或者損傷骨折愈合相關(guān)細胞的正常代謝和功能,從而阻斷骨折愈合的過程,因此細菌感染是骨折不愈合或延遲愈合的主要的原因之一,骨折愈合的過程就是成骨細胞參與鈣化并最終生成骨質(zhì)的病理炎性修復(fù)過程,期間病原體感染可導致局部炎癥介質(zhì)的釋放,最終引起免疫反應(yīng),導致成骨細胞壞死或者凋亡,造成成骨功能障礙,最終導致不愈合。細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是細菌內(nèi)毒素的主要成分,包括特異性多糖,非特異性多糖和類脂A,其中類脂A是主要的毒性部分,而細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的特有結(jié)構(gòu),其也是細菌主要的致熱源,有相關(guān)研究表明,細菌釋放的脂多糖是導致開放性骨折不愈合的主要原因,脂多糖炎癥過程如何引起局部的炎癥反應(yīng),其反應(yīng)通過何種通路影響成骨細胞,形成骨質(zhì)的具體作用機制尚不清楚,國內(nèi)外缺乏相關(guān)的研究,而該問題對于臨床治療骨折不愈合或者延遲愈合其意義重大。炎癥反應(yīng)是機體對于外界的侵害和損傷的一種正常的防御,其有益于正常的骨折愈合過程,但是骨折后大量炎癥因子的釋放就會導致成骨細胞不能成骨或者破骨細胞活化。有研究報道,炎癥導致的骨折不愈合,主要是由于細菌脂多糖引起的成骨細胞炎癥反應(yīng),例如白細胞介素-1,白細胞介素-6和活化因子配基(RANKL)釋放,或者是誘導成骨細胞分泌破骨細胞激活因子,從而能誘導破骨細胞成熟和激活。但是對于細菌脂多糖如何介導成骨細胞內(nèi)信號傳導的機制尚不清楚。Toll樣受體(Toll-LIKE RECEPTOR,TLR)是參與非特異性免疫的一類重要的蛋白分子,TLR是機體天然的監(jiān)控器,可以監(jiān)視各種不同的疾病分子模式,是機體抵抗感染的首要通道。TLR可以識別細菌脂多糖,從而誘導分泌促炎細胞因子。Toll樣受體識別細菌脂多糖發(fā)揮炎癥作用主要是通過Toll樣受體信號傳導的髓樣分化因子(MyD88)依賴機制,其主要過程是,配體結(jié)合TLR后導致MyD88聚集在TLR的TIR結(jié)構(gòu)域,聚集后髓樣分化因子與IRAK相互作用,使其磷酸化,磷酸化后的IRAK與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子結(jié)合,最后介導炎癥反應(yīng)。也就是說細菌脂多糖通過TLR介導的髓樣分化因子生成的炎癥因子發(fā)揮著抑制成骨細胞成骨過程,但其具體機制如何尚不清楚。骨折發(fā)生后,在各種炎癥因子和其他細胞因子的作用下,骨折附近骨髓的間充質(zhì)干細胞分化發(fā)育成,成骨細胞,其轉(zhuǎn)化和分化的過程調(diào)節(jié)非常精密復(fù)雜,其作用機制如何,近年來有相關(guān)報道,有學者發(fā)現(xiàn),閉合性骨折斷端runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-2(Runx2)及骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)的水平增高,也有研究發(fā)現(xiàn),如果實驗動物敲除了runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-2,其成骨細胞水平降低,骨折愈合困難,因此可以初步認為runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-2作為啟動成骨細胞分化的鑰匙,有研究發(fā)現(xiàn),runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-2,信號通路的激活與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein,BMP)體激活導致的細胞內(nèi)磷酸化相關(guān),而前者正是形成骨鈣蛋白,刺激成骨的關(guān)鍵因素。因此本研究針對感染導致骨不連,骨折不愈合,以小鼠成骨細胞為研究對象,推測細菌脂多糖通過Toll樣受體對成骨細胞分化的影響,通過測量堿性磷酸酶的活性,骨基質(zhì)骨化、堿性磷酸酶、骨鈣蛋白和Runx2的表達,明確脂多糖對于成骨細胞分化和基質(zhì)礦化的影響；同時通過核糖核酸干擾技術(shù),進一步明確脂多糖TLR-4依賴通路對成骨細胞分化的影響。本文研究的成果可以為細菌感染導致的骨折不愈合,提供分子生物學基礎(chǔ),也為感染導致的骨折不愈合治療及藥物靶點的選擇,提供新的思路,由于本文的結(jié)果可以直接指導臨床預(yù)防骨折不愈合具有重要意義。目的：(1)培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1.(2)用不同濃度的脂多糖培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1,利用免疫蛋白印跡測量TLR-4蛋白水平。(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測量,不同濃度劑量的脂多糖處理小鼠成骨細胞系MC3T3-E1中成骨標志物ALP,OCN and Runx2的mRNA水平的變化,從而分析脂多糖對于成骨細胞成骨功能影響的計量依賴性。(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于小鼠成骨細胞系MC3T3-E1,檢測成骨細胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計量依賴性,從而分析不同濃度的脂多糖對于成骨細胞,成骨作用的影響。(5)不同濃度的脂多糖作用于去除siRNA-TLR-4表達(對TLR-4特異的siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞)小鼠成骨細胞進行培養(yǎng),利用Von Kossa法測量基質(zhì)骨化程度,檢測堿性磷酸酶的活性,并測量不同劑量的脂多糖對基因敲除成骨細胞細胞活性和凋亡的影響。方法：(1)細胞系、組織、處理方法小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞用ATCC配方Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。細胞溶液中添加10%的胎牛血清,100 units/mL的青霉素和100mg/mL的鏈霉素,放在5%CO2,37℃的加濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。脂多糖(LPS)用苯酚從大腸桿菌0111：B4提取純化,并溶解在含2%血清α-MEM溶液中。設(shè)置脂多糖干擾組時,我們用0,50,100,200,or 400ng/mL脂多糖分別培養(yǎng)濃度為85%的成骨細胞0,4,8,12,or 24h,為敲除TLR-4表達,將30or 60nM siRNA-TLR-4脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到成骨細胞,用任意序列的RNA作對照。(2)蛋白印跡分析細胞漿的蛋白用細胞裂解液提取,并輔以蛋白酶抑制劑。蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚乙二烯硝酸纖維素膜上。然后非特異性結(jié)合位點的被5%脫脂牛奶阻斷并在40C過夜,然后用TLR-4的兔多克隆抗體或a磷酸甘油醛脫氫酶在室溫下孵育2h,然后接種用過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體在室溫下封閉1h。最后,用化學免疫發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)檢測特異性結(jié)合。TLR-4水平用其與GAPDH相對灰度值表示。(3) Von Kossa染色和堿性磷酸酶活性的測定為了觀察脂多糖對小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞分化的影響,將細胞在含10%胎牛血清α-MEM中培養(yǎng)并用0、50、200或400ng/ml的脂多糖干擾。用Von Kossa染色法測量MC3T3-E1細胞基質(zhì)礦化水平。通過堿性磷酸酶實驗測量堿性磷酸酶的活性,將MC3T3-E1細胞碎裂,用2毫克蛋白濃度的細胞裂解液加入到測定緩沖液(1 mM氯化鎂,50 mM Tris-HC1,pH 9.2)(同時加入2mM磷酸對硝基苯酚)在37℃孵育10min后,再用0.45 MNaOH終止,在420nm處用對硝基苯酚處理后,測量吸光度。我們用與對照組相比較相對值來表示堿性磷酸酶活性檢測的結(jié)果(4)實時反轉(zhuǎn)錄PCR測量TLR-4,ALP,OCN和Runx2的水平用mRNA Isolation and Purification試劑盒從細胞中分離總mRNA,取1μgmRNA,用one-step SYBR Green PCR Kits試劑盒合成檢測與TLR-4,ALP,OCN和Runx2配對鏈。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)TLR-4,ALP,OCN和Runx2的配對鏈的合成后將與分離的mRNA溶液混合,利用LightCycler 2.0系統(tǒng)進行檢測。所有實驗均重復(fù)三次。用甘油醛-3磷酸脫氫酶做參照,基因轉(zhuǎn)錄水平的相對量用2-ΔAct法測定。(5)MTT細胞活性檢測細胞活性用MTT法進行測定。簡要步驟為,將MC3T3-E1細胞分別放在含有0、50、100,200或400 ng/ml的脂多糖溶液中培養(yǎng)24h。同時設(shè)有空白對照組。加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT,將細胞置于37℃培養(yǎng)4h。之后小心移除上清,每孔加入100ul二甲基亞砜,放置于搖床上震蕩10分鐘,充分溶解結(jié)晶,用移液器反復(fù)吹吸使晶體溶解。培養(yǎng)板放于37℃培養(yǎng),溶解氣泡后,用全自動定量繪圖酶標儀(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)在570nm波長下測定,結(jié)果計算公式為(實驗孔的A570)／(對照孔的A570)×100%。(6)細胞凋亡檢測用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒,分析細胞凋亡的百分率。用MC3T3-E1細胞處理過的細胞在2000rpm下離心5min,然后用PBS洗滌兩次,吸取250ul的2×Binding Buffer和250ul去離子水,混勻,接著將細胞懸浮于400μl1×Binding的緩沖液中,使?jié)舛葹?×105cells/mL,再加入5gLAnnexin V-FITC和碘化丙啶,上下顛倒混勻。處理過的細胞放于暗室進行5-15min放射處理,然后進行流動細胞計數(shù)分析,流式細胞儀參數(shù)調(diào)節(jié)(EX=488nmEm=530nm)檢測細胞凋亡的情況,綠色銀光采用FITC通道通常為FL2來檢測,紅色熒光通過P1通道一般為FL1來檢測。統(tǒng)計學處理：全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,多組間不同組別間差異比較采用方差分析,兩組間比較采用雙尾t檢驗,顯著性水平設(shè)定為0.05,當P值小于0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果(1)脂多糖能夠促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞生成TLR-4為了研究脂多糖在成骨細胞分化中的作用,我們首先研究脂多糖干擾的小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞Toll樣受體-4的水平。小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞分別于0、50、100、200或400ng/mL的脂多糖共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),mRNA TLR-4的水平會隨著脂多糖的計量的增大而升高,說明mRNA TLR-4與脂多糖呈計量依賴性,同時還驗證了mRNA TLR-4的水平與處理時間的相關(guān)性,由實驗結(jié)果得出小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞TLR-4 mRNA的水平在用200ng/mL脂多糖共培養(yǎng)4h后迅速提高,培養(yǎng)6h和8h,TLR-4 mRNA的水平維持到一定的高值,其中培養(yǎng)8h后達到峰值,與培養(yǎng)4h和6h組比較,差異具有統(tǒng)計學意義。為了研究不同濃度脂多糖共培養(yǎng)小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞中TLR-4蛋白表達水平與脂多糖濃度的相關(guān)性,同樣用0、50、100、200or400ng/mL濃度的脂多糖分別與小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨著脂多糖計量水平的升高,TLR-4蛋白表達水平逐漸升高,且呈劑量依賴性,0、50、100、200or 400 ng/mL濃度脂多糖組間比較差異具有統(tǒng)計學意義,MC3T3-E1細胞TLR-4的水平在用200ng/mL脂多糖共培養(yǎng)4h后迅速提高,培養(yǎng)6h和8h,TLR-4的水平維持到一定的高值,其中培養(yǎng)6h后達到峰值,與培養(yǎng)4h和8h組比較,差異具有統(tǒng)計學意義。綜上所述,不同濃度的脂多糖與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng),隨著計量的增高和時間的延長,其TLR-4在mRNA水平和蛋白水平均提高,呈劑量和時間的依賴性。LPS抑制成骨細胞堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化為了探討脂多糖對成骨細胞分化的影響,通過將脂多糖與小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞共同培養(yǎng),檢測成骨細胞基質(zhì)骨化和堿性磷酸酶活性水平。研究顯示,用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細胞MC3T3-E1,其細胞的堿性磷酸酶活性顯著降低,不同濃度組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈劑量依賴性(P<0.05),用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細胞MC3T3-E1,其細胞的基質(zhì)骨化水平顯著降低,不同濃度組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈劑量依賴性(P<0.05),當200或400ng/mL脂多糖加入到MC3T3-E1成骨細胞培養(yǎng),成骨細胞MC3T3-E1形成礦化點明顯減少(P<0.01200 ng/ml的LPS或P<0.001 400 ng/ml的LPS,圖2C),呈劑量依賴性(P<0.01)LPS對成骨細胞成骨標志物的影響堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx2是成骨細胞分化的標志物,堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx2水平的提高可表明成骨細胞分化成熟水平提高。運用實時定量PCR研究不同劑量的脂多糖與MC3T3-E1成骨細胞培養(yǎng),堿性磷酸酶mRNA水平的調(diào)節(jié)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)隨著脂多糖濃度的提高,成骨細胞堿性磷酸酶mRNA水平顯著性升高,其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計學意義。尤其是當濃度大于100ng/ml時,堿性磷酸酶mRNA水平顯著性下降,當濃度大于400ng/ml時,堿性磷酸酶mRNA水平最低。我們發(fā)現(xiàn)骨鈣素水平與脂多糖計量關(guān)系是：隨著脂多糖濃度的提高,成骨細胞骨鈣素水平顯著性下降,其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計學意義。尤其是當濃度大于200ng/ml時,骨鈣素水平顯著性下降,當濃度大于400ng/ml時,骨鈣素水平最低。研究發(fā)現(xiàn)Runx2水平與脂多糖計量關(guān)系是：隨著脂多糖濃度的提高,成骨細胞骨Runx2的骨化點顯著性下降,其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計學意義。尤其是當濃度大于200ng/ml時,骨化水平顯著性下降,當濃度大于400ng/ml時,固化點水平最低。4脂多糖對于核糖核酸干擾介導,敲除TLR-4成骨細胞分化的影響為了進一步探討TLR-4在脂多糖誘導成骨細胞分化,抑制中發(fā)揮的作用,我們在小鼠成骨細胞MC3T3-E1中敲除TLR-4,用不同濃度的脂多糖進行共培養(yǎng)處理,檢查基質(zhì)骨化狀態(tài)、堿性磷酸酶活性、骨鈣素和Runx2水平。通過TLR-4-specific siRNAs轉(zhuǎn)染小鼠成骨細胞MC3T3-E1后,成骨細胞TLR-4的表達顯著性降低,基質(zhì)骨化的水平顯著性升高,骨鈣素和OCN的水平也顯著性的高于對照組,經(jīng)統(tǒng)計學比較,差異具有統(tǒng)計學意義,p=0.012本部分從遺傳學基因水平證實了TLR-4為脂多糖誘導成骨細胞分化的作用靶點。結(jié)論(1)我們成功培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1.(2)脂多糖促進了成骨細胞MC3T3-E1 TLR-4蛋白表達,且呈計量和時間的相關(guān)性。(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測量,不同濃度劑量的脂多糖處理的成骨細胞系MC3T3-E1中成骨標志物堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx2的變化,脂多糖對于成骨細胞三種成骨功能標志影響存在計量依賴性,呈負相關(guān)。(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于成骨細胞系MC3T3-E1,檢測成骨細胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計量依賴性,同時測量了不同劑量對成骨細胞凋亡和活性的影響,脂多糖對于成骨細胞,成骨作用具有抑制反應(yīng),同時可以降低成骨細胞活性提高成骨細胞凋亡的比例。(5)敲除TLR-4的成骨細胞MC3T3-E1其基質(zhì)骨化程度和堿性磷酸酶、OCNRunx2的mRNA水平增高,敲除TLR-4的小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞活性提高,細胞凋亡率降低。