幾種抗原修復法的簡單介紹

抗原修復就是利用虎穴試劑盒熱的作用將抗原重新暴露出現(xiàn)或修正過來的過程。

常用抗原修復法介紹：

1. 真空負壓抗原修復法：

① 切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負壓干燥箱預先調(diào)至95℃，真空負壓處理10分鐘。

⑤待修復注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的年免疫組化染色方法進行染色。

這是一種操作簡單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點有四：一是各物質(zhì)的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機會；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發(fā)生變性，又不需要使抗原修復液達到沸騰，不會導致切片因抗原修復液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復制片的麻煩，保證了病理報告的及時發(fā)生，為病人爭取更多的時間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進行操作；四是可以一次性制作大批的切片。

2.微波輻射抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學的染色方法進行染色。

該法與上法相比，從實驗結(jié)果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運動產(chǎn)生瞬間熱。當然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達到目的。應用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質(zhì)分子作極性運動。促進形成的醛鍵斷裂開。分子間運動所產(chǎn)生的瞬間熱，當達到有效的溫度后，就可導致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點是：產(chǎn)熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復液的沸騰，使用微波爐時禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。

3.高壓抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4分鐘。

⑤待修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。

該法高壓和高熱來促進醛鍵的斷裂，當加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時的溫度已達121℃左右。該法被應用于一些較難修復的抗原，經(jīng)多次實驗認為，該法效果不錯。

4.隔水熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開始計時，持續(xù)40分鐘。

⑤待抗原修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。

該法應用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長時間的熱的作用，在早期應用于Er和Pr染色的抗原修復時，我們的修復時間為40分鐘，如果達不到這時間，效果將不理想。

5.電爐加熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 將切片放入抗原修復液中于電爐上加熱，不時用溫度計測量溫度，當達92℃后，即可拔離電源，當溫度低于92℃時，再插上電源，如此反復持續(xù)至10分鐘左右。

⑤待抗原修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進行染色。

對各種抗原修復方法的評價。

該法是在沒有上述的設(shè)備時才選用的一種方法，當然效果是最差的，因為它只是單靠熱的作用，這是遠遠不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計來測量溫度，對其溫度不好控制，有時需要多次關(guān)閉電源來維持所需的溫度。

抗原修復的方法選擇

抗原修復關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。不適當?shù)目乖迯头绞綍е氯旧蹶栃?。因此應當根?jù)不同的抗原特點，采用不同的修復方法。不適當?shù)目乖迯头绞綍е氯旧蹶栃浴Ｒ虼藨敻鶕?jù)不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細胞 間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要 視組織固定的不同，所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，應通過預實驗摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內(nèi)抗原，如 Keratin，CEA，GFAP等。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化，如 fibronectin，Laminin，各型膠原等。消化時間和組織固定的長短呈正比。 在 用酶消化，熱修復后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復與酶消化結(jié)合的方法，有時會取得較為滿意的結(jié)果。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合，但應注意，可能檢測的抗原無論何種性質(zhì)均會在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應。以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。 緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。

免疫組化抗原修復法的注意事項：

1、pH的應用范圍及選擇

抗原修復液的pH非常重要，有效的抗原修復pH要比修復液的化學成分更重要，同樣的修復液隨著pH的升高染色的強度逐漸增強，但最佳pH范圍為6.0-10.0。目前大家公認的最好的抗原修復液是pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液。作為通用修復液堿性pH的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH的修復液則優(yōu)于堿性的修復液。

2、抗原修復時應選擇最佳溫度

70-90℃的溫度對未經(jīng)固定的蛋白質(zhì)可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白質(zhì)，溫度必須達到92℃以上方能使其變性。研究結(jié)果顯示，溫度為92-98℃是合適的，95℃效果最好。

3、抗原修復液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的

抗原修復持續(xù)時間過后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，絕對不能為了爭取時間，強行用冰塊或冷水使其降溫。這是因為當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個自然環(huán)境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復原來的形態(tài)和構(gòu)型。