一、基本原理
本方法先借助長(zhǎng)期混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法獲得抗原特異性CTL，然后再進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)。其原理為：外周血淋巴細(xì)胞包含針對(duì)不同抗原的特異性CTL克隆，在體外經(jīng)某一特定（或同種異體細(xì)胞）抗原刺激后，能識(shí)別該抗原的T細(xì)胞克隆被選擇性激活、增殖，而其他T細(xì)胞克隆則逐漸死亡；經(jīng)3~4次刺激后，存活的均為識(shí)別特異性MHC/抗原肽復(fù)合物的細(xì)胞，即抗原特異性CTL 。
二、試劑及材料
1. 絲裂霉素C（Sigma）：用培養(yǎng)液或PBS配制300μg/ml。
2. 含20%的新生牛血清的RPMI 1640
3. EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞株
三、操作方法
1. 特異性CTL的誘導(dǎo)和制備
① 取作者外周血分離PBMC，無(wú)血清1640洗兩遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640調(diào)成1.5×106 /ml，置于24孔板中，于5% CO2 培養(yǎng)箱中4小時(shí)使單核細(xì)胞貼壁以去除之，然后收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)；
② 取EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞，加入絲裂霉素C，最終濃度為30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀細(xì)胞用1640液洗滌3次并計(jì)數(shù)；
③ 取2×106 個(gè)PBL于24孔板中，加入5×104 （2.5%）個(gè)經(jīng)絲裂霉素C處理（30mg/ml、30min）的自身、同種異體（其HLA-I類(lèi)型別完全不同）的EBV-LCL細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，混勻，用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640）補(bǔ)總體積至2ml；
④ 靜置于培養(yǎng)箱中；4d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3d；
⑤ 離心收集細(xì)胞，取1×106 個(gè)反應(yīng)細(xì)胞，加入2×105個(gè)（20%）的刺激細(xì)胞，第三天加入重組IL-2，使終濃度為30U/ml；每三天半量換液一次并維持相同IL-2濃度。
⑥ 每周按相同程序刺激效應(yīng)細(xì)胞一次，3~4次后，效應(yīng)細(xì)胞即為特異性CTL，可用于殺傷實(shí)驗(yàn)。
2. 細(xì)胞毒試驗(yàn)
檢測(cè)CTL細(xì)胞毒作用均可采用檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性的方法，僅效靶細(xì)胞比例不一樣，現(xiàn)將LDH釋放法簡(jiǎn)要敘述如下：
① 靶細(xì)胞為用作刺激細(xì)胞的自身或同種異體EBV-LCL細(xì)胞，調(diào)成1×105/ml；
② 效應(yīng)細(xì)胞為上述誘導(dǎo)的特異性CTL，調(diào)成2.5×106/ml；
③ 各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值為25:1）；輕輕吹打，使二者混勻；同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組（即只加靶細(xì)胞而不加效應(yīng)細(xì)胞）和最大釋放對(duì)照組（0.1ml靶細(xì)胞和0.1ml 1% NP-40）；
④ 1000rpm/min離心2min后，置37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育4hr
⑤ 酶促顯色反應(yīng)：參見(jiàn)“NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)”。
