NK細(xì)胞活性測定：LDH法

一、原理

活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有LDH。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。LDH 可使乳酸鋰脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H＋被還原成紫紅色甲月贊類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測定。

二、儀器和材料

酶標(biāo)儀、YAC-1細(xì)胞、Hank''s液（pH7.2～7.4）、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）、1%NP40或2.5%Triton

三、實驗步驟

1、LDH基質(zhì)液的配制

乳酸鋰5×10-²mol/L

硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10^-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS） 2.8×10^-4mol/L

氧化型輔酶Ⅰ（NAD） 1.3×10^-3mol/L

將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH8.2）

2、靶細(xì)胞的傳代（YAC-1細(xì)胞）

實驗前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank''s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10⁵個/mL。

3、脾細(xì)胞懸液的制備（效應(yīng)細(xì)胞）

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank''s液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，或用4層紗布將脾磨碎，或用Hank''s液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min離心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)（活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上），用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁷個/mL。

4、NK細(xì)胞活性檢測

取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1％NP40或2.5%Triton各100μL；上述各項均設(shè)三個復(fù)孔，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl₃0μL，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值（OD）。

按下式計算NK細(xì)胞活性，受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對照組的NK細(xì)胞活性，即可判定該項實驗結(jié)果陽性。

                                     反應(yīng)孔OD－自然釋放孔OD

NK細(xì)胞活性（%）＝ ────────────────── ×100%

                                   最大釋放孔OD－自然釋放孔OD

四、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

NK細(xì)胞活性需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X＝Sin-1 ，式中P為NK細(xì)胞活性，用小數(shù)表示，然后再進(jìn)行方差分析，在進(jìn)行方差分析時，需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值< F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

五、注意事項

1、靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞必須新鮮，細(xì)胞存活率應(yīng)大于95％。

2、比色時環(huán)境溫度應(yīng)保持恒定。

3、LDH基質(zhì)液應(yīng)臨用前配制。

4、在一定范圍內(nèi)，NK細(xì)胞活性與效靶比值成正比。一般效靶比值不應(yīng)超過100。