免疫熒光法的解決方法

注意事項

1. 在使用前，一抗二抗均應測試其合適的稀釋度。

2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標本經多聚甲醛固定后，應再用去污劑處理，如果標本在水溶液中浸泡的時間過長，則會使交聯(lián)結構解體。因此，應避免固定后的標本在水溶液中浸泡的時間過長。

3. 信號微弱的解決方法：

① 提高一抗和二抗的濃度以增強敏感性 ，這必須測試各種濃度抗體的滴度；

② 延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結合時間較在溶液中長。孵育時間可因實驗設計作適當調整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結合。在以上兩點中，應摸索出一個最佳條件以產生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復試驗，因為每組抗體和抗原的情況會有所不同；

③ 改變檢測方法，用共聚焦顯微鏡觀察，可提高敏感性。

4. 背景不好的解決方法

細胞樣本進行熒光染色時，背景問題主要來自兩個方面，即非特異性染色和特異性交叉反應。

① 非特異性吸附：非特異性吸附背景問題的產生與抗原抗體的特異性結合無關。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附，而不是與抗原發(fā)生特異性結合。

*將所有抗體溶液或含蛋白的檢測試劑用100，000′g離心30min以去除蛋白聚合物。

*滴定一抗和所用的檢測試劑，以確定能夠產生合適信號的最低濃度。

*固定后，用飽和量并不被檢測試劑結合的非特異性抗體封閉樣品，有效的封閉液包括5%的與標記二抗來源相同的同種血清、3%的BSA和3%的脫脂奶粉。

*用上述封閉液稀釋抗體和檢測試劑。

*固定后，在所有的緩沖液及洗滌液中加入2%吐溫-20。

*縮短一抗或標記試劑的孵育時間。

*充分洗滌（延長洗滌時間，重復次數）。

*改變檢測方法。

② 特異性背景：造成特異性背景問題的原因有三種因素，即污染抗體所致假陽性、交叉反應和樣品中含有能與Ig結合的蛋白質。

*如用多克隆抗體，應滴定抗體（假陽性）。

*如用多克隆抗體，親和純化特異性抗體（假陽性）。

*如用多克隆抗體，用適當的丙酮肝臟粉吸收以阻抑假陽性。

*換用其他抗體（交叉反應及假陽性）。