石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)
免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 （多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三種最常用。今天主要介紹免疫酶法。
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免疫酶法實(shí)驗(yàn)原理
根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子， 其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。
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實(shí)驗(yàn)步驟
1. 石蠟切片置于 67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小時(shí)，脫蠟至水，用 pH7.4 的 PBS 沖洗三次，每次 3 分鐘（3×3'）。
2. 取一定量 pH=6.0 檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理 10 分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用 PBS 沖洗 2×3'。（注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定）
3. 每張切片加 1 滴 3% H2O2，室溫下孵育 10 分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS 沖洗 3×3'。
4. 除去 PBS 液，每張切片加 1 滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育 2 小時(shí)。
5. PBS 沖洗 3×5'。除去 PBS 液，每張切片加 1 滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育 20 分鐘。PBS 沖洗 3×3'。
6. 除去 PBS 液，每張切片加 1 滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育 30 分鐘。PBS 沖洗 3×5'。
7. 除去 PBS 液，每張切片加 1 滴新鮮配制的 DAB 液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察 5 分鐘。
8. 蘇木素復(fù)染，0.1% HCl 分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。
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實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)
1. 在切片加上一抗后，第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物與一抗結(jié)合，在多聚螯合物上有大量的 HRP 分子，使抗原信號(hào)有顯著的放大，其敏感性較 SABC、SP 法高。
2. 由于多聚物在體內(nèi)不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比 SABC、SP 法清晰。
3. 辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上，替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，且試劑孵育時(shí)間短，只需 15 分鐘，使得免疫組化方法更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間比 SABC、SP 法大為縮短。
