免疫組化技術(shù)是當(dāng)今廣泛應(yīng)用的檢測組織切片內(nèi)特定蛋白的實(shí)驗(yàn)手段。利用圖像分析軟件來判讀切片圖像上蛋白表達(dá)程度是隨著軟件技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用到免疫組化技術(shù)中的。
組織上的蛋白表達(dá)程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進(jìn)行判讀，最多粗略地作一個主觀的分級評價。使用圖像分析軟件則可以對圖片染色的程度作一個定量的測量。這個測量結(jié)果與切片上的蛋白表達(dá)強(qiáng)度有理論上的線性相關(guān)性。所以能客觀定量地反映它。
在圖像分析的方法中，使用灰度來表示一個點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）”決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類似于分光光度計的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測量一個點(diǎn)的光密度值，就是在測量這個點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個相對的量值。
朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbC
A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度
c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度
請注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再強(qiáng)調(diào)要測量光密度值的原因。
在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量分析樣品的實(shí)際濃度，但在組織切片的情形下，是沒法作標(biāo)準(zhǔn)曲線的。所以我們只能測量到一個相對值。能對不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測量到這個點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來，就得到一個積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來相對定量地來表示。
光密度值是一個相對的數(shù)值，所以它是沒有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒有單位的。
這種相對的測量數(shù)值對我們設(shè)計圖像分析方法有直接的影響。我們沒法通過圖像分析的方法測量出切片上有多少測定的蛋白。只能通過比較的方法來判斷實(shí)驗(yàn)組樣品與對照組樣品之間的蛋白表達(dá)差異。
