爭抑制ELISA方法的建立
3.1 抗體的酶標(biāo)記及質(zhì)量鑒定
本試驗(yàn)采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標(biāo)記在抗體上[1]，標(biāo)記完后取上清用Sephedex G200 凝膠層析進(jìn)行純化，洗脫液為0.2mol/L pH7.4的PBS，流速為15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度計(jì)測A280吸光度值，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，收集第一峰即為酶標(biāo)抗體峰。
標(biāo)記完后用紫外分光光度計(jì)在分別在280nm、及403nm處測定酶標(biāo)記物的A值，計(jì)算免疫球蛋白量、摩爾比值、酶結(jié)合率以及標(biāo)記率。
3.2 包被用緩沖液及最適包被抗原濃度的優(yōu)化
3.2.1 包被緩沖液的優(yōu)化
包被抗原時(shí)，為了得到最佳的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標(biāo)抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇最佳的包被緩沖液系統(tǒng)（表5）。同時(shí)為了保證緩沖液能夠長期保存，我們在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。
3.2.2 最適抗原包被濃度的優(yōu)化
用優(yōu)化好的包被緩沖液，將包被抗原（ALB）稀釋成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六個(gè)濃度，包被微孔板，每孔100ul；競爭抗原濃度為4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶標(biāo)抗體稀釋度為1：300，經(jīng)孵育、顯色、終止后用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析（表6）。顯色的強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強(qiáng)度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。
3.3 封閉液、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化
3.3.1 封閉液的優(yōu)化
采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。
3.3.2 洗滌液的配制
采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制洗滌液。
3.3.2 酶標(biāo)板保護(hù)液的優(yōu)化
酶標(biāo)板經(jīng)過封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長固相酶標(biāo)板上抗原的穩(wěn)定性，我們增加了一步保護(hù)酶標(biāo)板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價(jià)金屬離子，作為酶標(biāo)板保護(hù)劑，在封閉完后加入保護(hù)液于4℃冰箱中孵育過夜，同時(shí)與未做保護(hù)的酶標(biāo)板進(jìn)行對照，然后將保護(hù)的及未保護(hù)的酶標(biāo)板置于37烘箱中放置15天，考察保護(hù)液對酶標(biāo)板的穩(wěn)定性的影響。
3.4 酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標(biāo)抗體做系列稀釋：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析（表7），選擇A值為1.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為最適工作濃度。
3.5 酶標(biāo)抗體保護(hù)液的優(yōu)化
低濃度的酶標(biāo)抗體極容易受到高溫、微生物、以及蛋白酶的影響而失活，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的貨架期，過去通常將酶標(biāo)抗體凍干保存，然而這樣的保存，不僅由于在凍干的過程中會(huì)影響酶標(biāo)抗體的活性，而且在臨床應(yīng)用中頗為不便。適當(dāng)?shù)木彌_液以及添加無關(guān)蛋白質(zhì)、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會(huì)對對酶標(biāo)抗體的活性起一定的保護(hù)作用，因此我們設(shè)計(jì)了一組保護(hù)劑用于保護(hù)酶標(biāo)抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標(biāo)抗體做對照，將經(jīng)保護(hù)的酶標(biāo)抗體及未保護(hù)的酶標(biāo)抗體置于37℃烘箱中放置6天，考察保護(hù)液對酶標(biāo)抗體的影響。
3.6 底物液的優(yōu)化
常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng)，由于OPD有致癌的危險(xiǎn)性以及用前需要溶解等諸多缺點(diǎn)，因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng)，采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法：取適量的TMB溶解在DMSO中，然后加入適量的超純水，配制作為底物B液；溶解適量的過氧化氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制作為底物A液，用前將底物A液及底物B液等體積混合。
在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，我們適當(dāng)調(diào)整了TMB的用量以及過氧化氫尿素的用量，并加入了酶促進(jìn)劑，與文獻(xiàn)報(bào)道的底物進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)方案為：將活化的辣根過氧化物酶分別作1：1000；1：10000；1：100000；1：200000；1：400000；1：800000等系列稀釋，比較兩種不同配方的底物的靈敏度（表10）。
3.7 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液
我們采用10mM的磷酸鹽緩沖液內(nèi)含0.5%的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的稀釋液。
3.8 抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
抗原抗體反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的增加，反應(yīng)量也增加，但達(dá)到一定的時(shí)間后，反應(yīng)即達(dá)到平衡，我們?nèi)》磻?yīng)10min，20min，30min，40min，50min，60min，
70min,90min等8個(gè)點(diǎn)進(jìn)行比較（表11），以確定最佳抗原抗體反應(yīng)時(shí)間。
3.9 底物作用時(shí)間的優(yōu)化
在其它條件相同的情況下，我們?nèi)?min,10min,15min,20min,25min,30min,35min
40min,50min,60min,80min等11個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較（表12），確定最佳的底物作用時(shí)間。
3.10 劑量反應(yīng)曲線的建立及曲線擬合方式的確定
在其他參數(shù)均已經(jīng)優(yōu)化完成的情況下，將抗原標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，
0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12個(gè)稀釋度，同時(shí)設(shè)置陰性和空白對照，加入已包被好抗原的酶標(biāo)板中，同時(shí)加入酶標(biāo)抗體，經(jīng)孵育、顯色、終止后用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析（表12），采用文獻(xiàn)報(bào)道的4P對數(shù)擬合曲線
