檢測原理: 

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人IL-8抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的

人IL-8會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IL-8抗體和辣根過氧化

物酶標(biāo)記的親和素?？谷薎L-8抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IL-8結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)

合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化

下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，IL-8濃度與OD450值之間

呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中IL-8的濃度。 

樣品收集: 

1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集

血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。 

2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可

檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)

影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體

積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。

推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組

織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，

取上清檢測。 

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。 

5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 

6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 

7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍

存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。 

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先

做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。 

試驗(yàn)所需自備物品: 

1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片) 

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 

4. 吸水紙 

檢測前準(zhǔn)備工作: 

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)

晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超

過50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。 

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，

靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為2000pg/mL）。

然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃

度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空

白孔0pg/mL。如配制1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL2000pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)

準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  

4. 生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配

制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作

濃度。當(dāng)日使用。 

5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制

100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

當(dāng)日使用。 

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋，如200μL/管） 

 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 

 2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0 pg/mL 

洗滌方法: 

1. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 

2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸

去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。 

操作步驟: 

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL，余孔分

別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸

及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次

實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前 15 分鐘

內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育 1 小時(shí)。 

3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙

上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 

4. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 

5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情 

況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。 

7. 每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液

的加入順序相同。 

8. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀

器，設(shè)置好檢測程序。 

9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。 

注意事項(xiàng)： 

1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)

光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。 

2. 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成

任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！ 

3. 加樣：加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的

“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間最好控制在

10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 

4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)

板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。 

5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸

水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 

6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較

小，運(yùn)輸過程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶

蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗

體工作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請

精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection 

Ab時(shí)，一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋

過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次

用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。 

7. 顯色時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很

明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 

8. 底物：底物請避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 

9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量

振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 

10. 安全：試驗(yàn)中請穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品

時(shí)，請按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。 

11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外） 

12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！ 

結(jié)果判斷: 

1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)

品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度

為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，

由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程

式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 

3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 

靈敏度、檢測范圍、特異性和重復(fù)性: 

●靈敏度：最小可測 18.75pg/mL。 

●檢測范圍：31.25–2000pg/mL。 

● 特異性：可檢測重組或天然的人 IL-8，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 

● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。 

操作概要 

1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘 

2. 倒去孔內(nèi)液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘 

3. 洗滌 3 次 

4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 

5. 洗滌 5 次 

6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右 

7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值 

8. 結(jié)果計(jì)算  

問題分析 

若實(shí)驗(yàn)效果不好，請及時(shí)對顯色結(jié)果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后

聯(lián)系我公司技術(shù)支持為您解決問題。同時(shí)您也可以參考以下資料： 

問題描述 可能原因 相應(yīng)對策 

標(biāo)準(zhǔn)曲線梯

度差 

吸液或加液不準(zhǔn) 檢查移液器及吸頭 

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不正確 溶解標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)稍微旋轉(zhuǎn)瓶身，輕輕混勻使粉末完全溶解 

洗滌不完全 保證洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 

顯色很弱或

無色 

孵育時(shí)間太短 保證充足的孵育時(shí)間 

實(shí)驗(yàn)溫度不正確 使用推薦的實(shí)驗(yàn)溫度 

試劑體積不夠或漏加 

檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加 

稀釋不正確 

讀數(shù)數(shù)值低 酶標(biāo)儀設(shè)置不正確 

在酶標(biāo)儀上檢查波長及濾光片設(shè)置 

提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱 

變異系數(shù)大 加液不正確 檢查加液情況 

背景值高 

檢測抗體的工作濃度

過高 

使用推薦的稀釋倍數(shù) 

酶標(biāo)板洗滌不完全 

重新閱讀操作手冊，保證清洗完全；如果用自動(dòng)洗板機(jī)，

請檢查所有的出口是否有堵塞 

洗液有污染 配制新鮮的洗液 

靈敏度低 

ELISA 試劑盒保存

不當(dāng) 

按說明書要求保存相關(guān)試劑 

讀數(shù)前未終止 OD 讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液 

聲明 

1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存

在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。 

2. 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請

務(wù)必準(zhǔn)備充足的待測樣品。 

3. 只有全部使用試劑盒內(nèi)的試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)

格遵守實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到最佳的檢測結(jié)果。 

4. 有效期：6 個(gè)月。 

5. 本操作說明同樣適用于 48T 試劑盒。