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大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要

發(fā)表時(shí)間:2015-11-10

大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要

特別說明: 

*: [96T/48T](打開包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整) 

#: 一周內(nèi)使用可存于4℃,需長(zhǎng)時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃. 

相關(guān)試劑在分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,請(qǐng)?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出! 

檢測(cè)原理: 

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠sICAM-1/CD54抗體包被于酶標(biāo)板上,實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品

或標(biāo)準(zhǔn)品中的大鼠sICAM-1/CD54會(huì)與包被抗體結(jié)合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的

抗大鼠sICAM-1/CD54抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗大鼠sICAM-1/CD54抗體與結(jié)合在

包被抗體上的大鼠sICAM-1/CD54結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的

成分被洗去。加入顯色底物(TMB),TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色,加終止液后變成

黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值,sICAM-1/CD54濃度與OD450值之間呈正比,通過繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中sICAM-1/CD54的濃度。  

大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要樣品收集: 

1. 血清:全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),收集

血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原,無內(nèi)毒素試管。 

2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,取上清即可

檢測(cè)。避免使用溶血,高血脂樣品。 

3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)

影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體

積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。

推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組

織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,

取上清檢測(cè)。 

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。 

5. 其它生物樣品:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè) 

6. 樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。 

7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次使用量分裝,凍

存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),避免反復(fù)凍融。 

8. 如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值,請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況,做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議先

做預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定稀釋倍數(shù))。 

 

試驗(yàn)所需自備物品: 

1. 酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片) 

2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水 

4. 吸水紙 

 大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 

1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。 

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)

晶,屬于正常現(xiàn)象,可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超

過50℃,使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。當(dāng)日使用。 

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘,加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,旋緊管蓋,

靜置10分鐘,上下顛倒數(shù)次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為2000pg/mL)。

然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋(注:不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋)。建議配制成以下濃

度:2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL,標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空

白孔0pg/mL。如配制1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5mL2000pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo) 

準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。 

4. 生物素化抗體工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配

制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作

濃度。當(dāng)日使用。 

5. 酶結(jié)合物工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制

100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

當(dāng)日使用。 

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋,如200μL/管) 

 

 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 

 2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0 pg/mL 

 大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要

洗滌方法: 

1. 自動(dòng)洗板機(jī):每孔加入洗滌液350μL,注入與吸出間隔60秒。 

2. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,在潔凈的吸水紙上拍干,每孔加洗滌液350μL,浸泡1-2分鐘,吸

去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在厚的吸水紙上拍干。 

 

操作步驟: 

實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫;試劑或樣品配制時(shí),均需充分混勻,并盡量避免起泡。 

1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL,余孔分

別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100μL,注意不要有氣泡,加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸

及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育 90 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次

實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 

2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100μL(在使用前 15 分鐘

內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37℃溫育 1 小時(shí)。 

3. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分鐘,大約 350μL/每孔,甩干并在吸水紙

上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 

4. 每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用前 15 分鐘內(nèi)配制)100μL,加上覆膜,37℃溫育 30 分鐘。 

5. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 5 次,方法同步驟 3。  

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右(根據(jù)實(shí)際顯色情

況酌情縮短或延長(zhǎng),但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí),即可終止)。 

7. 每孔加終止液 50μL,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液

的加入順序相同。 

8. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD 值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源,預(yù)熱儀

器,設(shè)置好檢測(cè)程序。 

9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。 

 

注意事項(xiàng): 

1. 保存:試劑盒中各試劑請(qǐng)按說明書提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)

光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。 

2. 酶標(biāo)板:剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成

任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋,按推薦溫度存放! 

3. 加樣:加樣或加試劑時(shí),第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的

“預(yù)溫育”時(shí)間,從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間最好控制在

10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 

4. 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜;洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,避免酶標(biāo)

板處于干燥狀態(tài);嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。 

5. 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸

水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 

6. 試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較

小,運(yùn)輸過程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,以使附著管壁或瓶

蓋的液體沉積到管底。取用前,請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗

體工作液、酶結(jié)合物工作液請(qǐng)根據(jù)所需用量配制,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請(qǐng)

精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection 

Ab時(shí),一次不要小于10μL),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差;請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋

過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次

用量分裝,將其放在-20~-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。 

7. 顯色時(shí)間的控制:加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很

明顯,請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。 

8. 底物:底物請(qǐng)避光保存,在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 

9. 混勻:充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要,最好使用微量振蕩器(使用最低頻率),如無微量

振蕩器,可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 

10. 安全:試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品

時(shí),請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。 

11. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外) 

12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴(yán)禁混用,否則將影響試驗(yàn)結(jié)果! 

結(jié)果判斷: 

1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)

品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度

為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件,如curve expert 1.3或1.4,在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,

由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程

式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。 

3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 

大鼠細(xì)胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要 

靈敏度、檢測(cè)范圍、特異性和重復(fù)性: 

●靈敏度:最小可測(cè) 18.75pg/mL。 

●檢測(cè)范圍:31.25–2000pg/mL。 

● 特異性:可檢測(cè)重組或天然的大鼠 sICAM-1/CD54,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 

● 重復(fù)性:板內(nèi),板間變異系數(shù)均<10%。 

 

操作概要 

1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL, 37℃孵育 90 分鐘 

2. 倒去孔內(nèi)液體,加入 100μL 生物素化抗體工作液,37℃孵育 60 分鐘 

3. 洗滌 3 次 

4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液, 37℃孵育 30 分鐘 

5. 洗滌 5 次 

6. 加入 90μL 底物溶液, 37℃孵育 15 分鐘左右 

7. 加入 50μL 終止液,立即在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量 OD 值 

8. 結(jié)果計(jì)算


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