大鼠I型膠原α1(COL-1α1) ELISA試劑盒操作概要
特別說明:
*: [96T/48T](打開包裝后請及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整)
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃,需長時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃.
相關(guān)試劑在分裝時(shí)會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,請?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出!
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠COL1α1抗體包被于酶標(biāo)板上,實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)
品中的大鼠COL1α1會與包被抗體結(jié)合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠COL1α1
抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素??勾笫驝OL1α1抗體與結(jié)合在包被抗體上的大鼠COL1α1
結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),
TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色,加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測
OD值,COL1α1濃度與OD450值之間呈正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中COL1α1的濃度。
樣品收集:
1. 血清:全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原,無內(nèi)毒素試管。
2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,取上清即可
檢測。避免使用溶血,高血脂樣品。
3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會
影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體
積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,
取上清檢測。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。
5. 其它生物樣品:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測
大鼠I型膠原α1(COL-1α1) ELISA試劑盒操作概要
6. 樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測,請按一次使用量分裝,凍
存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融。
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值,請根據(jù)實(shí)際情況,做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議先
做預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定稀釋倍數(shù))。
試驗(yàn)所需自備物品:
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
檢測前準(zhǔn)備工作:
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶,屬于正常現(xiàn)象,可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超
過50℃,使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。當(dāng)日使用。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘,加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,旋緊管蓋,
靜置10分鐘,上下顛倒數(shù)次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為20ng/mL)。
然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋(注:不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋)。建議配制成以下濃
度:20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔
0ng/mL。如配制10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5mL20ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣
品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用。
5. 酶結(jié)合物工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋,如200μL/管)
1 2 3 4 5 6 7 8 Tube
20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0 ng/mL
洗滌方法:
1. 自動洗板機(jī):每孔加入洗滌液350μL,注入與吸出間隔60秒。
2. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,在潔凈的吸水紙上拍干,每孔加洗滌液350μL,浸泡1-2分鐘,吸
去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在厚的吸水紙上拍干。
大鼠I型膠原α1(COL-1α1) ELISA試劑盒操作概要
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫;試劑或樣品配制時(shí),均需充分混勻,并盡量避免起泡。
1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL,余孔分
別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100μL,注意不要有氣泡,加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸
及孔壁,輕輕晃動混勻。給酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育 90 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次
實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液 100μL(在使用前 15 分鐘
內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37℃溫育 1 小時(shí)。
3. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分鐘,大約 350μL/每孔,甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用前 15 分鐘內(nèi)配制)100μL,加上覆膜,37℃溫育 30 分鐘。
5. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 5 次,方法同步驟 3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右(根據(jù)實(shí)際顯色情
況酌情縮短或延長,但不可超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí),即可終止)。
7. 每孔加終止液 50μL,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液
的加入順序相同。
8. 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源,預(yù)熱儀
器,設(shè)置好檢測程序。
9. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。
大鼠I型膠原α1(COL-1α1) ELISA試劑盒操作概要
注意事項(xiàng):
1. 保存:試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,否則可能會出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
2. 酶標(biāo)板:剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成
任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋,按推薦溫度存放!
3. 加樣:加樣或加試劑時(shí),第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的
“預(yù)溫育”時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間最好控制在
10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。
4. 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜;洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,避免酶標(biāo)
板處于干燥狀態(tài);嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
5. 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
6. 試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較
小,運(yùn)輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前,請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗
體工作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請
精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection
Ab時(shí),一次不要小于10μL),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋
過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次
用量分裝,將其放在-20~-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。
7. 顯色時(shí)間的控制:加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很
明顯,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
8. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
9. 混勻:充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要,最好使用微量振蕩器(使用最低頻率),如無微量
振蕩器,可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
10. 安全:試驗(yàn)中請穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時(shí),請按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外)
12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴(yán)禁混用,否則將影響試驗(yàn)結(jié)果!
結(jié)果判斷:
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)
品的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度
為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件,如curve expert 1.3或1.4,在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,
由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程
式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測,計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
大鼠I型膠原α1(COL-1α1) ELISA試劑盒操作概要
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復(fù)性:
●靈敏度:最小可測 0.188ng/mL。
●檢測范圍:0.313–20ng/mL。
● 特異性:可檢測重組或天然的大鼠 COL1α1,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
● 重復(fù)性:板內(nèi),板間變異系數(shù)均<10%。
操作概要
1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL, 37℃孵育 90 分鐘
2. 倒去孔內(nèi)液體,加入 100μL 生物素化抗體工作液,37℃孵育 60 分鐘
3. 洗滌 3 次
4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液, 37℃孵育 30 分鐘
5. 洗滌 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液, 37℃孵育 15 分鐘左右
7. 加入 50μL 終止液,立即在 450nm 波長處測量 OD 值
8. 結(jié)果計(jì)算