Human ATF-1 ELISA Kit
特別說明:
*: [96T/48T](打開包裝后請及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整)
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃,需長時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃.
相關(guān)試劑在分裝時(shí)會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,請?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出!
Human ATF-1 ELISA Kit
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人ATF1抗體包被于酶標(biāo)板上,實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中
的人ATF1會與包被抗體結(jié)合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人ATF1抗體和辣根過
氧化物酶標(biāo)記的親和素??谷薃TF1抗體與結(jié)合在包被抗體上的人ATF1結(jié)合、生物素與親和素特
異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),TMB在辣根過氧化物酶
的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色,加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值,ATF1濃度與OD450
值之間呈正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATF1的濃度。
樣品收集:
1. 血清:全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原,無內(nèi)毒素試管。
2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,取上清即可
檢測。避免使用溶血,高血脂樣品。
3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會
影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體
積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,
Human ATF-1 ELISA Kit取上清檢測。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。
5. 其它生物樣品:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測
具體處理方法可參考:
6. 樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測,請按一次使用量分裝,凍
存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融。
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值,請根據(jù)實(shí)際情況,做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議先
做預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定稀釋倍數(shù))。
Human ATF-1 ELISA Kit
試驗(yàn)所需自備物品:
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
檢測前準(zhǔn)備工作:
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶,屬于正?,F(xiàn)象,可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超
過50℃,使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫)。當(dāng)日使用。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘,加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,旋緊管蓋,
靜置10分鐘,上下顛倒數(shù)次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為100ng/mL)。
然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋(注:不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋)。建議配制成以下濃
度:100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白
孔0ng/mL。如配制50ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5mL100ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&
樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用。
5. 酶結(jié)合物工作液:實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量(以100μL/孔計(jì)),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。
Human ATF-1 ELISA Kit標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋,如200μL/管)