LXA4 (Lipoxin A4) ELISA Kit

脂氧素A4(LXA4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

檢測原理: 

本試劑盒采用競爭ELISA法。用LXA4抗原包被于酶標(biāo)板上，實驗時樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的LXA4與包被的LXA4競爭生物素標(biāo)記的抗LXA4單抗上的結(jié)合位點，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，LXA4濃度與OD450值之間呈反比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中LXA4的濃度。 

樣品收集: 

1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。 

2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。

推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。 

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。 

5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 

具體處理方法可參考：

6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 

7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。 

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。 

試驗所需自備物品: 

1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片) 

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 

4. 吸水紙 

檢測前準(zhǔn)備工作: 

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用 

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為50ng/mL）。

然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制25ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL50ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以50μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。 

5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

當(dāng)日使用。 

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管）